传染科
 血液科
 肿瘤科
 儿科
 皮肤性病科
 友情链接
人α1b型基因工程干扰素研究报告

——摘自中国国家科委主持的《人α1b型基因工程干扰素研究》鉴定会资料汇编

  干扰素是由人体细胞分泌的一类具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫活性的蛋白,近20年的临床试验表明,α型干扰素在治疗病毒性疾病和某些恶性肿瘤有效,但由于天然干扰素原材料来源困难,价格昂贵,不可能大量生产和应用。
  1984年中国预防医学科学院病毒学科学院病毒学研究所克隆了人α1b型干扰素基因,组建了工程菌,在大肠杆菌中获得表达,并进行了一些基础研究。卫生部上海生物制品研究所接着进行开发研究,这是第一个进行中试和进入临床试验的注射用基因工程产品,(1994年深圳科兴生物制品有限公司被中国卫生部批准进行大规模生产),由于国外未见有α1b型基因工程干扰素用于大规模制造和人体应用的报告,所以人 α1b基因工程干扰素的开发研究不仅难度大,而且风险也大。
  从1986-1992年经过七年多的研究,经历了实验研究——中试前试验——中试——临床前试验——临床试验—— 大规模制备等阶段,掌握了大规模制备人基因工程干扰素的技术,为发展我国基因工程生物制品和药品提供了经验。所制备的人α1b基因工程干扰素在临床试验中证明治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病有效,其效果与国外用α2b型基因工程干扰素相似,但有二点优于国外产品,一是毒副作用低于Schering公司的 α2b型,特别是用药后高热反应(38℃以上的较低),其次是长期注射应用后产生中和抗体的比率较低,已测定的连续注射三个月的患者血清42份无一例产生中和抗体,因为一有中和抗体产生,以后如再用同型干扰素治疗就会无效,Schering公司的 α2b型长期注射后产生中和抗体率为5~15%。兹将研究情况报告如下:


                  一、实验研究

 1. 基因、质粒和目的的基因产物的检定:对工程菌(大肠杆菌)的性状进行鉴定,排除了其他因子污染(如支原体、病毒等),对质粒作了酶切图谱鉴定,对基因作了核苷酸序列分析,对目的基因产物——人 α1b型干扰素作了型别鉴定证明确系a型干扰素,并验证了干扰素的表达量。
 2. 抗病毒作用:干扰素具有广谱的抗病毒作用,因此我们在Vero细胞中进行了人 α1b型基因工程干扰素抑制病毒试验. 表(略)

 
  以干扰素对VSV的抑制滴度作为1,与其他病毒比较,比1愈大表示愈不敏感。从表1可见 α1b型对多种病毒都有抑制作用其中以对Sindbis病毒最为敏感,而对腺病毒和疱疹病毒则需较大剂量才有抑制作用。
  另外α1b型干扰素对流行性出血热病毒和Coxsackie B3病毒(心肌炎的主要病原体)也有抑制作用,为今后扩大临床使用范围提供了实验依据。
 3. α1b干扰素在不同细胞中的抗病毒效价与重量的关系:α1b型干扰素是中国人周围血白细胞经病毒诱生后最常见的干扰素亚型,不同α亚型干扰素的抗病毒及其比活性差异主要决定于测定时所用的细胞系统,我们将 α2a型基因工程干扰素和α1b型基因工程干扰素同时在MDBK(传代小牛肾细胞)和WISH细胞中测定(均用VSV攻击),其结果见表2。

表(2)  人α1b干扰素在牛和人细胞上的抗病毒活性的比较
___________________________
 细胞   α2a型       α1b型 
     基因工程干扰素    基因工程干扰素
___________________________
 MDBK   244183       748016
 WISH   179994       48395
 比值   1.36        15.46
___________________________
  注:表中数字为干扰素效价系三份样本平均数

  由表2可见α2a型基因工程干扰素在MDBK和WISH细胞测定时抗病毒效价基本相同,但α1b则在WISH细胞中测定的效价比在MDBK细胞中测定的低15.46倍。就比活性来说,在MDBK细胞中测定 α1b和a2型为1~2×108国际单位(IU)/mg蛋白,而用WISH细胞,测定时 α1b为1~2×107IU/mg蛋白,因此建议进行人体应用时宜采用重量作剂量单位或以MDBK细胞上测定的效价为准。即a2型200万单位=10 mg(WISH或MDBK细胞),α1b型10万单位=10mg(WISH细胞测定);100~200万单位=10 mg(MDBK细胞测定)。相同重量剂量的a1b和a2在人细胞上诱生的2-5A合成酶的水平相近,在临床试验中40 mg/天的a1b型干扰素治疗慢性乙型肝炎的效果与国外报告的 α2b型500万单位/人/天的相似,证明了此点,另外在治疗疱疹性角膜炎和慢性宫颈炎时也得到验证,因此我们 α1b型是以重量表示,如我们的制剂为20mg/支,相当于α2的200~400万单位/支。
 4. 抗肿瘤作用
(1) 对Raji细胞抑制作用:采用H-TdR摄入试验,其结果见表3。
  表3 人α1b型干扰素对Raji细胞的抑制作用
______________________________
             α1b型干扰素浓度
_____________________________________________
      1000IU/ml   100IU/ml  10IU/ml   1IU/ml
__________________________________________________________ 
抑制率   20.0±3.1   17.7±2.8  8.2±6.1  3.7±3.3
————————————————————————————————
  从表3可见不同浓度的人α1b型干扰素对Raji细胞有程度不同的抑制作用,并与剂量相关,100IU/ml以上作用比较明显。
(2) 对人粘液表皮样癌细胞MEC-1株在裸鼠体内的抑瘤作用:MEC-1系人涎腺肿瘤细胞,由第四军医大学口腔医学院建株。试验时在裸鼠右肩背部皮下接种MEC-1细胞10 6个,肿瘤长至约0.6cm3时将动物随机分四组,第一组为对照,第二组为α1b型干扰素治疗组(10000IU/天),第三组为平阳霉素治疗组(0.32mg/天),第四组为 α1b型干扰素加平阳霉素联合治疗组,每天一次,共10次,其抑瘤率结果如表4。
表4 对粘度表皮样癌细胞的抑制作用
——————————————————————————————
    组别             抑瘤率(%)
——————————————————————————————
α1b型干扰素组            25.7
  平阳霉素              60.0
α1b型干扰素,平阳霉素联合组      97.14
——————————————————————————————    
  从表4可见α1b干扰素有明显的抑制粘液表皮样癌细胞在裸鼠体内的增殖,如与平阳霉素联合应用作用更为明显。
5. 增强NK细胞活性作用:人周围血NK细胞是机体执行免疫监视作用的一种重要细胞,是机体抗肿瘤作用的重要因素之一。用同位素51Cr释放法进行检测,在试验中 51Cr的自然释放率为7.76%,二次试验的结果见表5。
 表5 α1b型干扰素对NK细胞活性的影响
——————————————————————————————————
         干扰素用量(U/ml)   试验1()  试验2()
——————————————————————————————————
 对 照        -         23.158   23.96
—————————————————————————————————— 
          10           26.49   25.59 
          100          27.33   30.69 
 IFN-α1b     1000          38.92   35.08 
          10000         32.85    30.39
          100000        33.45    30.49
——————————————————————————————————
  表5可见α1b型干扰素有增强NK细胞活性的作用,10U/ml即有轻微作用,有随着剂量增加NK细胞活性逐步增强的趋向,但增加到10000~100000U/ml NK细胞活性并不继续增加,二次试验趋向一致。从上述结果可见我们从分子生物学、免疫学各方面都证明是 α1b型干扰素,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节活性,为进一步研究奠定了基础。


            二、临床前试验

1. 一般药理试验:在Beagle纯种狗中进行,按体重给予人用剂量3倍的人α1b型干扰素,结果对狗的神经系统、心血管系统和呼吸系统均未见有影响。
2. 急性毒性试验:用小白鼠尾静脉法进行试验,均未见有急性毒性的表现。
3. 长期毒性试验:我们按药品管理法的要求进行了为期六个月的长期毒性试验。用大白鼠和狗二种动物,大白鼠分五组每组20只,其中二组为对照组(PBS和2%白蛋白对照),人 α1b型干扰素用三个剂量,大剂量为人用剂量的140倍,中剂量为28倍,小剂量为0.56倍。狗(Beagle种)分为四组每组4只,如上二个对照组及中剂量和小剂量干扰素组,均为每天肌肉注射。在观察过程中除密切注意一般情况如活动、毛色、饮食及死亡等情况于用药后1、2、 4、8、12、16、20和24周进行血常规,血小板计数、肝功能、肾功能、心电图(仅给狗检查)。在3个月时半数动物进行解剖,肉眼观察各脏器的变化并作病理切片检查,6个月时再作同样检查,结果所有动物均未出现死亡,各组动物体重也无差别,病理检查未见有毒性意义的变化。

 4. 药代动力学试验:用大白鼠进行试验,肌肉注射200微克a1b型干扰素,在注射前和注射后0.5 1 2 4 8 16小时各取5只大鼠分别采血、尿、胆汁和粪,并解剖取心、肝、肺、肾、脾、脑、脂肪,注射部位肌肉生殖腺等测定干扰素含量,药代动力学的主要参数如下:半衰期(t 1/2 b)为1.4~1.56小时 。

  血液中干扰素最高浓度(Cmax)为4389~17487IU/ml
  获得最高血药浓度(Tm)在0.57~1.33小时
  分布容积(Vd)为248~355ml
  总清除率(CL)为1.6~1.9ml/分
  回归系数(R)为0.98~0.99之间,说明参数可靠性较好
  脏器分布:(见图2),注射局部含量最高,其次为肾、脾、肺、生殖腺、肝、心、脑、脂肪。
  排泄试验:尿、粪、胆汁均极少。
  从上述结果可见大剂量人α1b型基因工程干扰素肌肉注射后吸收很快,在给药后2~5小时内血液中保持一个相对稳定阶段,能很快分布于各脏器然后在体内降解。


              三、临床研究

  α1b型基因工程干扰素于1989年初经中国药品审评委员会组织专家审评后批准进行临床试验,治疗乙型肝炎,毛细胞白血病和丙型肝炎三种疾病总观察例数达到300例以上。乙型肝炎为主要试验病种,参加临床试验的有河南省医科所(临床负责单位),北京地坛医院、上海瑞金医院等15家医院,在双盲安慰剂对照试验中,37对病例的观察结果,对患者血清HBeAg阴转率治疗组为40.5%,对照组为8.1%,有显著性差别,对血清HBeAg的阴转率治疗组为57. 1%也与对照组有显著性差别,说明治疗慢性乙型肝炎是有效的。在以后Ⅱ期临床扩大试验200余例中也获得相似的效果,进一步证明其效果。参加毛细胞白血病临床试验的有医科院血液学研究所(临床负责单位)、北京协和医院等6家医院,有效率为63.64%。治疗丙型肝炎由北京地坛医院等3家医院,治疗后能使52.4%患者肝功能(ALT)恢复正常,对照组ALT复常率为7.2%,说明人α1b型基因工程干扰素治疗丙型肝炎有改善肝功能的效果。

网站导航     |     使用条款     |     法律声明     |     友情链接     |     流量分析     |     版权声明     |     联系我们
粤ICP备11052342号 | 深圳科兴生物工程有限公司 地址:深圳市南山区科苑路15号科兴科学园B栋1单元301